MDJ રિવ્યૂ ઓફ ધ યર: "ડીપ જીનોટાઇપિંગ" - ત્રીજી પેઢીના સિક્વન્સિંગ આપણને શું શીખવી શકે છે

લેખનું શીર્ષક છે, લોંગ રીડ સિક્વન્સિંગ અને ઓપ્ટિકલ જીનોમ મેપિંગ ટેક્નોલોજીનો ઉપયોગ કરીને ન્યુરોજનરેટિવ રોગોનું સંશોધન. આ મહત્વપૂર્ણ નોમિનેશન માટે આપ બંનેને અભિનંદન. ડૉ. કોગન, અમને તમારી પૃષ્ઠભૂમિ વિશે અને આ પેપર લખવા માટે તમને શું પ્રેરણા મળી તે વિશે થોડું કહો.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: નમસ્તે. અમારી સાથે આવવા બદલ આભાર. હું એક મેડિકલ જિનેટિસ્ટ છું અને હવે [00:01:00] હું પેરિસ બ્રેઈન ઇન્સ્ટિટ્યૂટમાં પીએચડી કરી રહ્યો છું. અને અમે પેરિસ બ્રેઈન ઇન્સ્ટિટ્યૂટ તરફથી નેશનલ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ હેલ્થ સાથે મળીને એક પ્રોજેક્ટ કર્યો હતો, અમારા સાથીદારો કે જે પેપરના સહ-લેખકો પણ છે, કેન્સુકે દૈડા, કોર્નેલિસ બ્લાઉવેન્દ્રેટ અને કિમ્બર્લી બિલિંગ્સલી સાથે.

તો મૂળભૂત રીતે અમારી પાસે વણઉકેલાયેલા PD કેસોનો સમૂહ હતો, જેમાં બ્લડ એક્સોમ સિક્વન્સિંગ હતું. અને અમારી પાસે કૌટુંબિક કેસ હતા અને શરૂઆતના કેસ પણ હતા અને અમે રોગનું કારણ બની રહેલા પરિવર્તન જેવું કંઈક ઓળખવાનો પ્રયાસ કરવા માંગતા હતા. અને આમ કરવા માટે, અમે લોંગ રીડ સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ કર્યો. હું ભવિષ્યમાં તેની વિગતોમાં જઈશ. અને અમારી પાસે એક રસપ્રદ કેસ હતો, અમે આની જાણ મૂવમેન્ટ ડિસઓર્ડર્સને કરવા માંગતા હતા, તેથી અમે કર્યું. સંપાદકે અમને લોંગ રીડ સિક્વન્સિંગ વિશે સમીક્ષા કરવા કહ્યું, પણ ઓપ્ટિકલ જીનોમ મેપિંગ પણ કરવા કહ્યું જેથી નવી ટેકનોલોજીની સમીક્ષા મેળવી શકાય જે નવી આનુવંશિક ટેકનોલોજીઓ આપણે ન્યુરોડિજનરેટિવ ડિસઓર્ડર્સમાં વાપરી શકીએ છીએ.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: ખૂબ સરસ. મને લાગે છે કે જિનેટિક્સ, તે ક્યારેક [00:02:00] ન્યુરોલોજીસ્ટ માટે એક પડકારજનક વિષય જેવું લાગે છે. તો ચાલો એક પગલું પાછળ ફરીએ અને મૂળભૂત બાબતોથી શરૂઆત કરીએ. આપણે ન્યુરોડિજનરેટિવ રોગોનું કારણ બનેલા પ્રકારો, સિંગલ ન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રકારો, માળખાકીય પ્રકારો અને પુનરાવર્તિત વિસ્તરણ વિશે વાત કરવા જઈ રહ્યા છીએ.

શું તમે કૃપા કરીને આ પ્રકારના પ્રકારોનો અભ્યાસ કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી તકનીકો સમજાવી શકો છો?

પ્રો. એલેક્સિસ બ્રાઇસ: હા, હું શરૂ કરી શકું છું અને ગુઇલોમ પૂર્ણ કરશે. મને લાગે છે કે ખરેખર મહત્વનું એ છે કે લાંબા વાંચન ક્રમનો અર્થ એ છે કે તમે ડીએનએના લાંબા ટુકડાઓનું વિશ્લેષણ કરી શકો છો, તેના બદલે દરેક ટુકડા માટે 150 થી 300 બેઝ જોડીઓ વાંચવા માટે તમારી પાસે દસ કિલો બેઝ જેવું કંઈક છે, અને આ ઘણો બદલાય છે.

કારણ કે તમે ઘણી બધી [00:03:00] પુનઃ ગોઠવણીઓ શોધી શકો છો, જે સામાન્ય તકનીકો દ્વારા શોધી શકાતી નથી. અને આનો અર્થ એ છે કે, ઉદાહરણ તરીકે, જ્યારે જનીનમાં વ્યુત્ક્રમ હોય ત્યારે તમે જંકશન બિંદુઓ જોઈ શકો છો. તમે તેમને ક્રમ આપી શકો છો. તમે ડુપ્લિકેશન અથવા ડિલીશન વધુ સરળતાથી શોધી શકો છો.

અને તે ઘણા ન્યુરોડિજનરેટિવ રોગો માટે પણ એક વિષય છે. અને પુનરાવર્તિત વિસ્તરણો પણ. નાનાને શાસ્ત્રીય તકનીકો દ્વારા પકડી શકાય છે, પરંતુ એકવાર તે 300 બેઝ પેરનું કદ ઓળંગી જાય, પછી તે કરી શકતા નથી. તેથી લાંબા વાંચન ક્રમ સાથે. ફરીથી, તમે આ પ્રકારના પ્રકારો પસંદ કરી શકો છો.

તો આ સૌથી મહત્વપૂર્ણ પાસાં છે. પરંતુ બીજા પણ છે. ઉદાહરણ તરીકે, તમે એવા વ્યક્તિઓને અલગ પાડી શકો છો જેમના જનીનમાં બે પ્રકારો હોય છે. તમે કહી શકો છો કે તેઓ સીઆઈએસમાં છે કે ટ્રાન્સમાં. અને રીસેસીવ રોગ માટે, [00:04:00] જો તમે ખાતરી કરવા માંગતા હોવ કે તેઓ રોગ માટે જવાબદાર છે, તો તેઓ ટ્રાન્સમાં હોવા જોઈએ.

તમે જનીન અને સ્યુડોજીન્સ માટે પણ એપ્લિકેશનો મેળવી શકો છો જ્યારે તેઓ ખૂબ જ સમાન હોય છે. લાંબા વાંચન ક્રમ ફરીથી જનીનને સ્વતંત્ર રીતે ક્રમ આપવા દે છે. તો તે ખરેખર મૂળભૂત છે અને જો તમે ઇચ્છો તો અમે ચોક્કસપણે થોડા ઉદાહરણો આપી શકીએ છીએ.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: ખૂબ સરસ. ખાસ કરીને જ્યારે મેં તમારો પેપર વાંચ્યો, ત્યારે મને ખૂબ જ રસપ્રદ લાગ્યું કે તમે લાંબા વાંચન ક્રમના ફાયદાઓ બતાવવા માટે આ ઉદાહરણોનો ઉપયોગ કરો છો જેમ કે તમે સ્યુડોજીન્સ અને ફેઝિંગનો ઉલ્લેખ કર્યો છે. શું તમે કૃપા કરીને PRKN વેરિઅન્ટ્સ ધરાવતા ભાઈ-બહેનો અને જોડિયા બાળકો વિશેની વાર્તા અમારી સાથે શેર કરી શકો છો? 

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: હા. તો NIH ના અમારા સાથીદાર, કેન્સુકે દૈડા, ને પહેલા આ બે ભાઈ-બહેનો પાર્કિન્સન રોગ સાથે સુસંગત ફેનોટાઇપ ધરાવતા હતા. [00:05:00] તો ભાઈ-બહેનોમાં રોગની શરૂઆત વહેલી હતી, રોગ ધીમો પ્રગતિ કરતો હતો અને મને લાગે છે કે તે એક્સોમ સિક્વન્સિંગ હતું. વાંચવા માટેનું આટલું ટૂંકું સિક્વન્સિંગ.

તેમની પાસે રોગકારક સિંગલ ન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રકાર હતો પરંતુ ફક્ત એક પ્રકાર હતો, તેથી તે રોગને સમજાવવા માટે પૂરતું નથી. અને પછી તેઓ લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કરે છે અને તેઓએ બીજા એલીલમાં એક વ્યુત્ક્રમ ઓળખ્યો, જે રોગને સમજાવી રહ્યો છે. અને વ્યુત્ક્રમ ખૂબ મોટો હતો. તે સાત મેગા આધાર છે.

તો તે સમજાવે છે કે તેમને પહેલા તે કેમ ન મળ્યું. અને પછી અમારા સમૂહમાંથી. અમારી પાસે બે ભાઈ-બહેનો પણ હતા જેઓ PRKN સાથે સુસંગત, ફરીથી, ફેનોટાઇપ સાથે, રોગના ઓટોસોમલ રિસેસિવ સ્વરૂપ ધરાવતા હતા. અને અમે પહેલા પરંપરાગત સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કર્યો, મલ્ટીપલ લિગેશન પ્રોબ એમ્પ્લીફિકેશન, એક્ઝોમ સિક્વન્સિંગ સાથે લક્ષિત સિક્વન્સિંગ.

અને અમારી પાસે એક્ઝોમ ચારનું ડિલીટેશન હતું, પરંતુ ફરીથી ફક્ત એક જ મ્યુટેશન હતું, તેથી તે રોગને સમજાવવા માટે પૂરતું ન હતું. અમે ફરીથી, લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કર્યો, અને અમને તે ખૂબ જ રસપ્રદ લાગ્યું. તેથી પહેલા અભ્યાસમાં [00:06:00] એક્ઝોમ ત્રણ અને એક્ઝોમ ચારનું ડિલીટેશન હતું, અને બીજા ઉમેરાયેલા અભ્યાસમાં એક્ઝોમ ત્રણનું ડુપ્લિકેશન હતું.

તો એકંદરે આપણી પાસે એક્સોમ થ્રીની બે નકલો છે, જે સામાન્ય છે, ખરું ને? મને આશા છે કે આપણી પાસે અહીં એક્સોમ થ્રીની બે નકલો હશે.

મને આશા છે અને તેથી જ અન્ય સિક્વન્સિંગ ટૂલ્સ તે જોઈ શક્યા નહીં. અને ફક્ત, ચાલો કહીએ કે ફક્ત લાંબા વાંચન સિક્વન્સિંગ જ આ ઓળખી શકે છે.

અને પછી કેન્સુકે અને તેમના સાથીઓએ આ અભ્યાસને વિસ્તૃત કર્યો, મને લાગે છે કે તે 23 વ્યક્તિઓ હતા જેમને એક PRKN પ્રકાર અને PD ની શરૂઆત થઈ હતી, અને તેઓ લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કરીને એક ચતુર્થાંશ કેસ ઉકેલવામાં સક્ષમ હતા. તેથી આ કંઈક અર્થપૂર્ણ છે, મને લાગે છે. અને ન્યુરોલોજીસ્ટ તેના વિશે વિચારી શકે છે જ્યારે તેમની પાસે PRKN માં એક પરિવર્તન અને સુસંગત ફેનોટાઇપ ધરાવતો દર્દી હોય.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: અને તમને ફક્ત ફેનોટાઇપિંગ માટે જ માર્ગદર્શન આપવામાં આવ્યું હતું. આ ખૂબ જ રસપ્રદ છે. તો તમે થોડું ખોદકામ કર્યું કે શું કોઈ માળખાકીય પ્રકાર છે જે ટ્રાન્સ [00:07:00] ભિન્નતામાં બીજાને સમજાવી શકે.

એ સાચું છે? 

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: અરે વાહ.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: અદ્ભુત. નવા જનીનો શોધવા ઉપરાંત, અન્વેષણ કરવા માટેનું બીજું રસપ્રદ પાસું એ છે કે પુનરાવર્તિત વિસ્તરણ લાક્ષણિકતા.

ફેનોટાઇપ અથવા આનુવંશિક પરામર્શને સમજવા માટે આ લાક્ષણિકતા કેવી રીતે સુસંગત છે?

પ્રો. એલેક્સિસ બ્રાઇસ: મને લાગે છે કે પુનરાવર્તિત વિસ્તરણ માટે ઓછામાં ઓછા બે પાસાં છે. પ્રથમ તે કદ છે અને યોગ્ય કદ બદલવું ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે કારણ કે સામાન્ય રીતે એક થ્રેશોલ્ડ હોય છે જેનાથી ઉપર પુનરાવર્તન રોગકારક કહી શકાય. અને આ વિકૃતિઓ અનુસાર ઘણું બદલાય છે. અને તેમાંથી કેટલાક માટે, મારે કહેવું પડશે કે થ્રેશોલ્ડ મૂલ્યવાન હોઈ શકે છે તે હજુ પણ વિવાદિત છે, પરંતુ ઓછામાં ઓછું ચોક્કસ મૂલ્યથી ઉપર, તમે ખાતરી કરો કે તે રોગકારક છે.

તો પહેલું પાસું કદ બદલવાનું છે, જે નિદાન માટે ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે. અને બીજું પાસું પુનરાવર્તનનો ક્રમ છે. કારણ કે તે તારણ આપે છે કે કેટલાક સ્થળોએ ફક્ત કદ જ નહીં, પણ પુનરાવર્તનની રચના પણ મહત્વપૂર્ણ છે. અને ત્યાં વૈકલ્પિક રચનાઓ છે, જેમાંથી કેટલીક રોગકારક છે અને અન્ય જે સારી રીતે સહન કરવામાં આવે છે અને રોગ સાથે સંકળાયેલ નથી.

લાંબા વાંચન ક્રમ સાથે, તમને એક જ પથ્થરથી બંને મળે છે. તમારી પાસે પુનરાવર્તનનું કદ અને રચના બંને છે, અને તેથી તમે કહી શકો છો કે પુનરાવર્તન રોગકારક છે કે નહીં. અને આ તાજેતરમાં ઓળખાયેલા ઘણા પુનરાવર્તનો માટે ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે જેમ કે FGF 14 અથવા RFC 1.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: હા, કદાચ હું તેના વિશે ઉદાહરણો આપી શકું છું. FGF 14 ખૂબ જ સારું ઉદાહરણ છે. તેથી તે [00:09:00] માટે જવાબદાર છે સ્પિનોસેરેબેલર એટેક્સિયા નંબર 27 B તાજેતરમાં ઓળખાયો હતો અને આપણે જાણીએ છીએ કે 200 કરતા ઓછા GAA ના વિસ્તરણ, તે રોગકારક નથી. જો કે, જ્યારે પુનરાવર્તન 300 થી ઉપર હોય છે, ત્યારે આપણે જાણીએ છીએ કે તે રોગકારક છે અને ટૂંકા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કરીને કારણ કે વાંચનનો ટુકડો લગભગ 150 છે.

આપણે કંઈ પણ લાંબું જાણી શકતા નથી. આપણે ફક્ત એટલું જ કહી શકીએ કે ૧૫૦ થી ઉપર વિસ્તરણ છે, પરંતુ આપણે કહી શકતા નથી કે તે ૩૦૦ થી ઉપર છે કે નહીં. તેથી આપણે કહી શકતા નથી કે તે રોગકારક છે કે નહીં અને તે કહેવા માટે આપણને બીજી ટેકનોલોજીની જરૂર છે. પરંતુ લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કરીને, આપણે વિસ્તરણનું કદ વધુ ચોક્કસ રીતે કહી શકીએ છીએ અને આપણે કહી શકીએ છીએ કે વિસ્તરણ થ્રેશોલ્ડથી ઉપર છે કે નહીં.

મોટિફના મહત્વનું બીજું ઉદાહરણ, તેથી તે જાણીતા સિન્ડ્રોમ સેરેબેલર એટેક્સિયા ન્યુરોપથી વેસ્ટિબ્યુલર એરેફ્લેક્સિયા સિન્ડ્રોમ માટે જવાબદાર જનીન છે, તેથી કેનવાસ. અને આપણે જાણીએ છીએ કે [00:10:00] AAAG ના લાંબા વિસ્તરણ, તેથી તે પાંચ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ છે. તે રોગકારક નથી. જો કે, મોટિફ AAGGG ના વિસ્તરણ રોગકારક છે અને લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કરીને, આપણી પાસે મોટિફ છે જેથી આપણે જાણી શકીએ કે તે રોગકારક છે કે નહીં.

અને મને લાગે છે કે વિક્ષેપોની હાજરી અથવા ગેરહાજરી પણ મહત્વપૂર્ણ છે. અને આપણે આ પેપરમાં આની ચર્ચા કરીશું. તો મને લાગે છે કે એક સારું ઉદાહરણ સ્પાઇનો સેરેબેલર એટેક્સિયા ટુ છે. તો તે CAG વિસ્તરણ છે. અને જો CAG ના આ વિસ્તરણમાં, આપણને CAG ને બદલે CAA ના વિક્ષેપ અથવા અનેક વિક્ષેપો આવે છે, તો આપણે જાણીએ છીએ કે તે સ્પાઇનોસેરેબેલર એટેક્સિયા માટે નહીં પરંતુ પાર્કિન્સન રોગ માટે જવાબદાર છે.

કારણ એ છે કે એકીકરણની હાજરી કે ગેરહાજરી મહત્વપૂર્ણ છે. ફિનોટાઇપ માટે, પણ ઉંમરની શરૂઆત, પ્રવેશ, રોગનો વારસો અને ફિનોટાઇપની તીવ્રતા અને પ્રકાર માટે પણ. 

પ્રો. એલેક્સિસ બ્રાઇસ: તેથી આપણે ભવિષ્યમાં [00:11:00] આ પુનરાવર્તનોની વધુ ઓળખ કરવાની અપેક્ષા રાખી શકીએ છીએ. અને આપણે જાણીએ છીએ કે ન્યુરોલોજીકલ ડિસઓર્ડરમાં ખાસ કરીને વારંવાર જોવા મળે છે.

તેથી મને લાગે છે કે, ઘણા વધુ કેસોને ક્રમ આપીને, આપણે ભવિષ્યમાં ચોક્કસપણે અજાણ્યા પરિવર્તનો શોધી શકીશું.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: અને તમે મિથાઈલેશન પણ ચકાસી શક્યા. તમે જનીન અભિવ્યક્તિ વિશે થોડું વધુ સમજી શકો છો.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: લાંબા વાંચન ક્રમની મુખ્ય પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને. આપણે મિથાઈલેશન ઓળખી શકીએ છીએ, અને અલબત્ત, રોગોમાં આના ઘણા અર્થ છે કારણ કે સામાન્ય રીતે હંમેશા એવું થતું નથી. પરંતુ સામાન્ય રીતે ડીએનએમાં હાઇપરમિથાઈલેટેડ તત્વોમાં હાઇપોમિથાઈલેશનની તુલનામાં ઓછી અભિવ્યક્તિ હોય છે.

અને ન્યુરોડિજનરેટિવ ડિસઓર્ડરના સંદર્ભમાં. મને લાગે છે કે આ રસપ્રદ છે. ઉદાહરણ તરીકે, જો આપણી પાસે જનીન હોય. મેં હમણાં જ NOTCH2NLC માટે આનો અભ્યાસ કર્યો છે, જે જ્યારે [00:12:00] તમને GGGC હોય છે, ત્યારે પાંચ પૂર્વ-મટીરિયલ ક્ષેત્રમાં વિસ્તરણ થાય છે. તે ન્યુરોનલ ઇન્ટ્રાન્યુક્લિયર હાયલાઇન ઇન્ક્લુઝન ડિસીઝ નામના રોગ માટે જવાબદાર છે, અને તેઓએ શોધી કાઢ્યું કે તે ખૂબ જ રસપ્રદ છે, આ રોગથી પ્રભાવિત બાળકોના બિન-અસરગ્રસ્ત માતાપિતામાં સંતાનની તુલનામાં લાંબા વિસ્તરણ હતા. તેથી તે અપેક્ષિત નથી, ખરું ને? પરંતુ લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કરીને, તેઓએ શોધી કાઢ્યું કે માતાપિતામાં આ GGC વિસ્તરણ હાઇપરમેથિલેટેડ હતું. તેથી નીચલા વિસ્તરણની તુલનામાં જનીન ઓછું વ્યક્ત થયું. અને આ વિસ્તરણ રોગકારક છે કારણ કે તે RNA 4 C તરફ દોરી રહ્યું છે જે RNA બંધનકર્તા પ્રોટીનના સિક્વેસ્ટ્રેશન તરફ દોરી જાય છે.

તેથી મૂળભૂત રીતે જો તમારી અભિવ્યક્તિ ઓછી હોય, તો તમારી પાસે RNA 4C ઓછું હોય છે અને પછી તમને રોગ નથી. એ જોવું ખૂબ જ રસપ્રદ છે કે મિથાઈલેશન આપણને સમજવામાં મદદ કરે છે કે કેટલાક પરિવર્તનો અન્યની તુલનામાં રોગકારક કેમ નથી.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: અદ્ભુત. ખૂબ જ રસપ્રદ. [00:13:00] ચાલો લાંબા વાંચન ક્રમમાં લક્ષ્યીકરણ વિશે થોડી વાત કરીએ. એપ્રિલ, 2024 માં, અમે પ્રો. હોલ્ડન અને ડૉ. ઝોંગબો ચેનનો ઇન્ટરવ્યુ લીધો હતો જેમાં SCA4 નું વર્ણન કરવા માટે લક્ષ્યાંકિત લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. શું તમે અમને યાદ કરાવી શકો છો કે આ પદ્ધતિ કેવી રીતે કાર્ય કરે છે અને શું દરેક વસ્તુને ક્રમ આપવાને બદલે લક્ષ્યીકરણ માટે બીજી પદ્ધતિ છે.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: હા. તો આ એક સારો પ્રશ્ન છે કારણ કે તમે લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ અનેક પાસાઓમાં કરી શકો છો. તેથી તમે સંપૂર્ણ જીનોમ ક્રમ પણ કરી શકો છો પરંતુ તમે લક્ષિત ક્રમ પણ કરી શકો છો. અને હું કહીશ કે, પેપરમાં આપણે આ કરવા માટે ત્રણ પદ્ધતિઓ વિશે વાત કરીશું. તો પહેલા તમે Cas9 આધારિત પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરી શકો છો.

તો તમે CRISPR Cas9 નો ઉપયોગ કરીને રસના ક્ષેત્રને પકડી શકો છો, અને પછી તમે ફક્ત રસના આ ક્ષેત્રને ક્રમ આપો છો. તો આ પહેલું છે. બીજું એક પણ સરળ છે. તે લાંબા અંતરનું PCR છે. તેથી તમે લાંબા [00:14:00] શ્રેણીના PCR નો ઉપયોગ કરીને તમારા રસના ક્ષેત્રને વિસ્તૃત કરો છો. પરંતુ અલબત્ત જો તમે આનો ઉપયોગ કરો છો, તો તમે એમ્પ્લીફિકેશન બાયસ મેળવી શકો છો કારણ કે તમે પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શનનો ઉપયોગ કરો છો, ખરું ને?

 તો આ બીજું છે, અને છેલ્લું ફક્ત ઓક્સફર્ડ નેનોપોર ટેકનોલોજીસ દ્વારા પૂરું પાડવામાં આવ્યું છે. તો છેલ્લું અનુકૂલનશીલ નમૂના છે અને તે ખૂબ જ રસપ્રદ છે.

તો મૂળભૂત રીતે તમારી પાસે DNA નો સ્ટ્રાન્ડ છે, જે છિદ્રમાંથી પસાર થઈ રહ્યો છે. અને છિદ્ર પ્રથમ 100 બેઝ જોડીઓનું વિશ્લેષણ કરશે. ઉદાહરણ તરીકે, 400 બેઝ જોડીઓ, અને તે જોશે કે શું આ બેઝ જોડીઓ તે રુચિના ક્ષેત્રમાં છે કે જે તમે સિક્વન્સિંગ મશીનને સિક્વન્સ કરવાનું કહ્યું હતું. તેથી જો તે જુએ છે કે આ ટુકડો રુચિનો ટુકડો નથી, તો તે ટુકડો બહાર કાઢે છે.

તેથી તે ફક્ત રુચિના છિદ્ર ટુકડાઓ દ્વારા જ ક્રમ કરશે. તો તે ત્રણ પદ્ધતિઓ છે: Cas9 આધારિત, લાંબા અંતરની PCR, અને ONT અનુકૂલનશીલ નમૂના.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: ખૂબ સરસ. પ્રોફેસર બ્રાઈસ, મને લાગે છે કે લાંબા વાંચનનું ક્રમ લગભગ ઊંડા ફેનોટાઇપિંગના આનુવંશિક સંસ્કરણ [00:15:00] જેવું છે, એક પ્રકારનું ઊંડા જીનોટાઇપિંગ. શું તમે સહમત છો?

પ્રો. એલેક્સિસ બ્રાઇસ: હું સંપૂર્ણપણે સંમત છું, ડીપ ફેનોટાઇપિંગ સાથે, તમને એવી વસ્તુઓ મળે છે જે તમે જોઈ નથી કારણ કે તમે તેમને યોગ્ય રીતે શોધી નથી. અને મને લાગે છે કે ન્યુરોલોજીસ્ટ માટે આ ડીપ ફેનોટાઇપિંગ કરવા સક્ષમ બનવું ખરેખર મહત્વપૂર્ણ છે, જે નિદાનમાં મદદ કરી શકે છે. અને અહીં તે બરાબર એ જ છે કારણ કે લાંબા વાંચન ક્રમ સુધી આપણે જે સાધનોનો ઉપયોગ કર્યો હતો તે આમાંના કેટલાક પ્રકારોને શોધી શક્યા ન હતા.

અને હવે જ્યારે આપણી પાસે આ સાધન છે, તો આપણે આ પ્રકારો શોધી શકીએ છીએ અને નિદાનમાં સુધારો કરી શકીએ છીએ. તેથી તે ખરેખર બરાબર છે, તે ખૂબ સમાન છે, સિવાય કે ડીપ ફેનોટાઇપિંગનો ખર્ચ ઓછામાં ઓછો હાલમાં લાંબા વાંચન ક્રમ કરતાં ઓછો હોઈ શકે છે.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: હા. લાંબા વાંચન ક્રમની વાત આવે ત્યારે પડકારો વિશે વાત કરીએ તો, આપણા માટે [00:16:00] મોટા પડકારો કયા છે? ખર્ચ ઉપરાંત.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: ખર્ચ ઉપરાંત, પડકારો સૌ પ્રથમ છે, વેટ લેબ. ​​તેથી વેટ લેબ પ્રોટોકોલ હજુ સુધી પ્રમાણિત નથી. ઉપરાંત, વેરિઅન્સને કૉલ કરવા માટે બાયોઇન્ફોર્મેટિક પાઇપલાઇન પ્રમાણિત નથી. અને તમને ઘણી બધી ડેટા સ્ટોરેજ ક્ષમતાઓની પણ જરૂર છે કારણ કે તે સેંકડો ગીગા બેઝ જનરેટ કરે છે.

તેથી તમારે સારી સ્ટોરેજ ક્ષમતાની જરૂર છે. સારા GPU અને CPU ને વેરિઅન્સ કહેવા માટે ખૂબ જ ગણતરીત્મક સઘન હોય છે અને સાંકળના અંતે, ચાલો કહીએ કે વેરિઅન્સનું અર્થઘટન કરવું એ પણ મુશ્કેલ છે કારણ કે આપણી પાસે ઘણું વધારે વેરિઅન્સ છે. ઓછામાં ઓછું આપણે આપણા વેરિઅન્સમાં વિશ્વાસ રાખીએ છીએ કારણ કે, ઉદાહરણ તરીકે, જો તમે ટૂંકા વાંચન ક્રમ કરો છો, તો તમે માળખાકીય વેરિઅન્સનું વિશ્લેષણ કરવાનો પ્રયાસ કરો છો, તમે જાણો છો કે તેમાંથી ઘણા ફક્ત ખોટા હકારાત્મક છે. પરંતુ લાંબા વાંચન ક્રમનો ઉપયોગ કરીને, તમે જાણો છો કે તેમાંથી મોટાભાગના સાચા હકારાત્મક છે. જો કે, જ્યારે આપણે વેરિઅન્સનું વિશ્લેષણ કરીએ છીએ, જો તમે દર્દીના રોગનું કારણ ઓળખવા માંગતા હો, તો તમે એવા વેરિઅન્સને દૂર કરવા માંગો છો જેની [00:17:00] આવર્તન સામાન્ય છે, ફક્ત આપણા બધામાં જ વેરિઅન્ટ પસંદ કરવા માટે.

વાત એ છે કે લાંબા સમયથી સિક્વન્સિંગ સાથે, આપણી પાસે ટૂંકા વાંચન સિક્વન્સિંગ માટે જીનોમ 80 જેવા કેટલોગ નથી. તેથી ટૂંકા વાંચન ભિન્નતાને ફિલ્ટર કરવું મુશ્કેલ છે. તેમ છતાં, કેટલાક સહયોગી પ્રોજેક્ટ્સ છે, ઉદાહરણ તરીકે, 1000 જીનોમ પ્રોજેક્ટ જે આપણને વસ્તી ડેટાબેઝ પ્રદાન કરવા માટે સેંકડો નહીં તો હજારો સ્વસ્થ નિયંત્રણોને સિક્વન્સ કરી રહ્યો છે, જે આપણને આવર્તન અનુસાર ભિન્નતાને દર્શાવવાની મંજૂરી આપે છે.

અને, અંતે, થોડો અનુભવ હોવા છતાં, તે ક્યારેક નિરાશાજનક હોય છે કારણ કે તમે એવું વિચારો છો કે, હું મારી પાસે રહેલા તમામ પ્રકારના ભિન્નતાને માળખાકીય ભિન્નતા SNDs તરીકે ક્રમ આપું છું, ટૂંકા વાંચન પુનરાવર્તનો, પરંતુ મને આનુવંશિક પરિવર્તન મળતું નથી. પણ હું જાણું છું કે તે અહીં ક્યાંક છે, પણ હું ફક્ત, હું કદાચ એક ઉદાહરણ લઈ શકું છું.

ઉદાહરણ તરીકે, આપણી પાસે આંતરિક માળખાકીય પ્રકારો છે જે જનીનના સ્પ્લિસિંગને અસર કરી શકે છે, પરંતુ આપણી પાસે એવું કોઈ સાધન નથી કે જે આગાહી કરી શકે કે તે સ્પ્લિસિંગને અસર કરી રહ્યું છે કે નહીં. તેથી અમે આશા રાખીએ છીએ કે ભવિષ્યમાં બાયોઇન્ફોર્મેટિશિયન [00:18:00] તે સાધનો વિકસાવશે જેથી આપણે આખરે આનુવંશિક વિકાર ધરાવતા બધા લોકોના રોગનું કારણ ઓળખી શકીએ, ચાલો કહીએ.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: અથવા તો બધા RNA ને પણ સિક્વન્સ કર્યા.

ડૉ. બ્રિસ અથવા કોગન: હા, આ બીજું છે. લાંબા ક્રમનો ઉપયોગ કરીને. હા, આપણે પેપરમાં વાત કરીએ તેમ નવા આઇસોફોર્મ્સ ઓળખી શકીએ છીએ.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: અને તમારા પેપરમાં તમે ઓપ્ટિકલ જીનોમ મેપિંગની શક્યતાઓ પણ શોધી કાઢી હતી. આ ટેકનિક કેવી રીતે કાર્ય કરે છે અને તેના મુખ્ય ફાયદા શું છે તે અમને સમજાવો.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: તો, તે લાંબા વાંચેલા ક્રમની તુલનામાં તદ્દન અલગ છે કારણ કે તે ક્રમ નથી. તેથી મૂળભૂત રીતે તમે ફક્ત તમારા ડીએનએને કેટલાક પ્રમાણભૂત ક્રમ, ટૂંકા ક્રમ પર લેબલ કરો છો, અને પછી તમારી પાસે એક માઇક્રોસ્કોપ છે જે તમારા ડીએનએના લેબલવાળા ટેગ વચ્ચેના અંતરને જોઈ રહ્યું છે. તેથી તેની મદદથી તમે 500 બેઝ જોડીઓથી ઉપરના માળખાકીય પ્રકારોને ઓળખી શકો છો.

તો તમે તેનાથી નીચે કંઈ જોઈ શકતા નથી. તે એક વાત છે. તમે [00:19:00] ઓપ્ટિકલ જીનોમ મેપિંગનો ઉપયોગ કરીને SNDs, સિંગલ ન્યુક્લિયોટાઇડ વેરિઅન્ટ પણ જોઈ શકતા નથી. જો કે, તે ખૂબ જ રસપ્રદ છે કારણ કે ઊંડાઈ, કવરેજ લાંબા વાંચન સિક્વન્સિંગની તુલનામાં વધુ સારું છે. તમે OGM નો ઉપયોગ કરીને 150 કવરેજ ડેપ્થ મેળવી શકો છો જ્યારે સામાન્ય રીતે લાંબા વાંચન સિક્વન્સિંગ સાથે 20 થી 30 x હોય છે.

અને, અને હા, હું કહીશ કે OGM ની મુખ્ય વાત એ છે. તેથી કેટલાક લોકોએ OGM અને લોંગ રીડ સિક્વન્સિંગની તુલના કરી. અને લોંગ રીડ સિક્વન્સિંગ માટે, 50 kb થી ઉપરના સ્ટ્રક્ચરલ ચલોને ઓળખવા મુશ્કેલ છે. જોકે, OGM એ પ્રકારના પરિવર્તનોને ઓળખવા માટે સારું છે. તેથી હું કહીશ કે જો તમારી પાસે પૈસા હોય, તો તમે બંનેનો ઉપયોગ કરી શકો છો અને તે જ શ્રેષ્ઠ રહેશે.

પણ તમારે કરવા માટે પૈસાની જરૂર છે 

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: કોર્સ છે.

પ્રો. એલેક્સિસ બ્રાઇસ: ના, મારો મતલબ છે કે, તમને ઉચ્ચ પરમાણુ વજન DNA ની પણ જરૂર છે અને તે ક્યારેક આ તકનીકો માટે મર્યાદા હોય છે. અને ક્લાસિકલ બાયોબેંકિંગ ક્યારેક નિષ્કર્ષણ તકનીકોનો ઉપયોગ કરે છે [00:20:00] જે આવા DNA પ્રદાન કરતી નથી. તેથી તમારે ઓછામાં ઓછું ધ્યાનમાં લેવું પડશે, સંભવિત જૂથો અથવા નમૂનાઓ માટે જે તમે મેળવી રહ્યા છો.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: હા. અને OGM માટે પણ કંઈક, મને લાગે છે કે OGM ની એક મર્યાદા જે શ્રોતાઓ માટે જાણવી સારી છે તે એ છે કે OGM નો ઉપયોગ કરીને બ્રેક પોઈન્ટનું ચોક્કસ સ્થાન મેળવવું ખૂબ મુશ્કેલ છે. તમે તે સામાન્ય રીતે મેળવી શકતા નથી. તે 6 KB થી 15 kb ની વચ્ચે હોય છે. તેથી તે તબીબી આનુવંશિકતામાં મહત્વપૂર્ણ હોઈ શકે છે કારણ કે OGM નો ઉપયોગ કરીને, તમે કહી શકો છો કે સ્ટ્રક્ચરલ વેરિઅન્ટ એક એક્સોમને આવરી લે છે, જ્યારે તે એવું નથી કે તે ખોટા પોઝિટિવ નથી, પરંતુ તે લાંબા વાંચન ક્રમ જેટલું સ્ટ્રક્ચરલ વેરિઅન્સ માટે સચોટ નથી.

તો ફરીથી, જો તમે OGM વાપરવા માંગતા હો, તો બંનેનો ઉપયોગ કરવો સારું છે, હા.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: તો શું તમે આગાહી કરો છો કે ભવિષ્યમાં વારસાગત ન્યુરોજનરેટિવ ડિસઓર્ડરનું નિદાન કરવા માટે આ બે ટેકનોલોજી પ્રથમ વર્ષનો અભિગમ બનશે કે બનશે? 

પ્રો. એલેક્સિસ બ્રાઇસ: જો તેમના માટે ચૂકવણી કરવા માટે [00:21:00] પૈસા હોય. હા, મને લાગે છે કે, તેઓ સ્પષ્ટપણે મોટા પ્રમાણમાં કેસ ઉકેલવાની મંજૂરી આપે છે અને તેથી તે ખૂબ ઉપયોગી છે. મને લાગે છે કે જો આપણે કોઈ અભિગમ રાખવા માંગતા હોઈએ તો પ્રથમ અને અંતિમ સ્તરનો અભિગમ અપનાવવો જોઈએ જ્યાં એક જ ટેકનોલોજી પરિણામો આપી શકે.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: હા, હું કહીશ કે આ ટેકનોલોજીઓને પહેલા સ્થાને લાવવા માટે હજુ ઘણી લાંબી મજલ કાપવાની છે. હા.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: હા. ખૂબ સરસ. આપણે વાત પૂરી કરીએ તે પહેલાં, શું તમે બંને અમારા શ્રોતાઓને આ પેપરમાંથી એક મુખ્ય સંદેશ આપવા માંગો છો?

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: હા. તો મને લાગે છે કે આ ટેકનોલોજીનો ઉપયોગ કરતા પહેલા તમારે તમારા પ્રોજેક્ટ અને ખરેખર તમે શું જોવા માંગો છો તે જાણવાની જરૂર છે. અને મને લાગે છે કે અમારા લેખમાં, અમે ઉદાહરણો આપવાનો શ્રેષ્ઠ પ્રયાસ કર્યો છે જેથી વાચક સમજી શકે કે તે આ ટેકનોલોજીમાંથી શું મેળવી શકે છે. અને મને લાગે છે કે હા, આ લેખ વાંચવો એ આને વધુ સારી રીતે સમજવાનો અને તેનો ઉપયોગ [00:22:00] દરેકના પ્રોજેક્ટ માટે યોગ્ય રીતે કરવાનો એક માર્ગ છે. હા.

ડૉ. સારાહ કેમાર્ગોસ: હા. તો ડોક્ટરો અમારી સાથે જોડાવા બદલ ખૂબ ખૂબ આભાર. અને આજે તમારી સમજ શેર કરી રહ્યા છીએ. MDS પોડકાસ્ટ પર અમારી સાથે રહેવા બદલ અમારા બધા શ્રોતાઓનો આભાર. અમારા આગામી એપિસોડ માટે જોડાયેલા રહો, અને ત્યાં સુધી કાળજી રાખજો અને ગુડબાય.

ડૉ. ગુઇલાઉમ કોગન: અમને રાખવા બદલ આભાર.